《内容》　本書は，その頁をひもとけば，リンパ球の同定・調整・分離・測定などの機能検索が実施できるよう具体的に解説したもので，ヒトおよびマウスにわけてこれらの手順，方法を注意点を説きながらつぶさに示したマニュアルである.80年3月刊行以来好評を得たものであるが今回，その後のめざましい進歩に対応し，新しい方法をとり入れ，Flow cytometryほか14項目を新たに加えた.改訂5版の序　本書の初版は1980年1月の発刊である.それから15年近くを経たことになるが，この間，1983年，1987年，1990年と改訂を行ってきた.したがって今回は改訂5版ということになる.リンパ球は免疫応答の中心になっている細胞であるから，研究の動向がどのように変化しようとも，リンパ球の量的，質的評価をするための方法論は常に必要である.本書がこれだけ長い間御利用頂けているのも，そのような御要望に応えることができているためでないかと思う.新しい方法論が開発された部分もあるし，その後の経験を踏まえ改善されたものもある.著者の方々には大変御苦労を頂いたが，ここに装いも新たに新しい版を世に出すことになった.今回も多くの方のお役に立てればと祈っている.1994年6月矢田純一藤原道夫はしがき　リンパ球は免疫機構の要ともいうべき存在である.リンパ球は抗原と特異的に反応できる唯一の細胞であり，抗原との特異的な反応は免疫応答を特徴づけているものだからである.　リンパ球の機能の解析が免疫機構の解明にどれだけ役立ったか計り知れないものがある.その研究上の要望を充すべくさまざまの方法論が開拓された.そのいくつかはリンパ球の研究を大いに飛躍させている.開発された数多くの方法論のいくつかは標準的なものとして定着してきている.　実験動物を用いたこのようなリンパ球の研究は免疫異常疾患の病態解明に大きな指針を与えている.その一方，臨床研究でえられた知見は動物での免疫学がどれだけ人間にあてはまるものなのかの限界を示す重要な手だてとなっている.　基礎研究でえられたリンパ球研究の方法論の一部はそのまま臨床研究にも応用されている.しかしその所見や意義づけは動物のものと微妙に異なっている場合もある.一方臨床研究の中で独自に開拓されてきた方法論も存在する.　人間のリンパ球に関する検査法と実験動物リンパ球の研究方法とを総括的に扱った本書の目的はそのような点を配慮したことにある.　日進月歩の分野である.次々と新しい方法論が開拓されていることは火をみるよりも明らかである.しかしながら，基本的方法論を集めた本書はそれなりに役割をもつものと考える.新しい方法論もその中から生れてくると信じるからである.　学究諸兄が本書を大いに活用し活発な研究をして頂くこと，本書を踏み台として更に進んだ方法論に発展させて頂くことを期待したい.1980年1月編集記す　　　　《目次》　目次●I.ヒトリンパ球機能の検索法§1.ヒトリンパ球の調整法 〈長沢正之〉3 1-1　末梢血リンパ球の分離法 3 1-2　固形リンパ組織からのリンパ球分離 6 1-3　骨髄血リンパ球の分離法 7 1-4　リンパ球の調整 8§2.リンパ球亜群の同定法 11 2-1　表面マーカーとリンパ球亜群の対応 〈長沢正之〉11 2-2　フローサイトメトリーによる解析 15 A.染色法・測定法 〈松田浩則　圓入克介〉15 B.FCM分析上の注意点 〈高瀬浩造〉31 C.白血球表面分子とCD分類 〈大川洋二〉41 D.細胞内抗原の分析 〈野々山恵章〉51 2-3　イムノービス法 〈大柴晃洋〉54 A.イムノビーズによるロゼット形成の原理 55 B.イムノビーズ法の基本操作 55 C.コーティング法 58 2-4　Eロゼット法 〈新保敏和〉60§3.リンパ球表面機能分子検出法 68 3-1　補体レセプター 〈平野隆雄〉68 A.補体レセプターの検出法 68 B.CR1以外の補体レセプターの検出 74 3-2　表面免疫グロブリン 〈高瀬浩造〉76 A.表面免疫グロブリン検出の目的 76 B.Fcレセプターの二重問題 76 C.実際の選択 77 D.保存／使用上の注意 77 3-3　T細胞抗原レセプター 〈森尾友宏〉79 A.T細胞抗原レセプター複合体 79 B.T細胞の陽性率を知る方法 81 C.TCRαβ，γδを検出する方法 81 D.TCR V領域(セグメント)の検出 82 E.CD3ζ(η)鎖の検出，TCR／CD3複合体のfull segmentの検出 82 3-4　接着分子 〈小池竜司　宮坂信之〉85 3-5　サイトカイン　レセプター 〈石川隆之　内山　卓〉92 A.単クローン抗体を用いたフローサイトメトリー法による受容体の検出 92 B.標識リガンドを用いた結合測定法による受容体の検出 93 C.標識リガンドを用いたクロスリンキング法による受容体の検出 99 3-6　Fcレセプター 〈辻村邦夫〉103 A.フローサイトメトリーによるFcRの検出法 103 B.EAロゼット形成によるFcRの検出法 107§4.リンパ球亜群の単離法 112 4-1　イムノビーズ法 〈大柴晃洋〉112 4-2　セルソーター(FACS) 〈高橋浩造〉116 A.原理 116 B.特徴 117 C.細胞分離の実際 117 D.無菌操作 122 E.キーポイント 123 F.具体的な細胞分取の例 124 4-3　ロゼット沈降法 〈新保敏和〉125 4-4　ナイロンウールカラム法 〈新保敏和〉131 4-5　密度勾配法 〈新保敏和〉137§5.組織におけるリンパ球亜群の同定法 〈今信一郎　菊地浩吉〉143 A.リンパ球亜群を識別する各種モノクローナル抗体の特性 143 B.免疫組織化学の実際 145§6.ヒトリンパ球の培養法 〈長沢正之〉150 A.ヒトリンパ球の増殖反応 151 B.混合リンパ球反応(mixed lymphocyte reaction) 153§7.免疫グロブリン産生能測定法 〈崎山幸雄〉155§8.サイトカイン産生能・サイトカイン測定法 160 8-1　IL-1 〈沖津祥子　吉野加津哉〉 160 A.IL-1産生能 160 B.IL-1測定法 162 8-2　ヒトIL-2 〈田中稔之〉 165 A.IL-2産生能 165 B.IL-2測定法 166 8-3　IL-3 〈東條有伸〉171 8-4　IL-4 〈善本知広　中西憲司〉175 A.ヒトIL-4産生誘導法 176 B.ヒトIL-4の測定 177 8-5　IL-5 〈山岡國士〉 183 A.イムノアッセイ 183 B.バイオアッセイ 184 8-6　IL-6 〈戸塚哲也　宮坂信之〉189 A.IL-6の産生法 189 B.IL-6の測定法 189 8-7　TNF 〈井上裕子　宮坂信之〉195 A.イムノアッセイ 195 B.バイオアッセイ 197 8-8　LT，パーフォリンの測定 〈内田温士〉200 A.LT／TNFβ(リンフォトキシン)の測定 200 B.パーフォリンの測定 202 8-9　インターフェロン 〈今西二郎〉205 A.インターフェロンαおよびβの産生法 205 B.インターフェロンγの産生法 206 C.インターフェロン測定法 206 8-10　LIF-MIF 〈杉山知行　中川　潤〉210 A.MIFの測定 210 B.LIFの測定 215 8-11　MAF 〈曽根三郎〉222 A.125I-IUdR遊離試験 223 B.51Cr遊離試験法 226§9.サイトカインmRNAの検出法 〈梶原道子〉229 9-1　mRNA分析法とその意義 229 9-2　RNA実験上の注意点　RNaseの混入を防ぐために 230 9-3　RNAの抽出(AGPC法による) 230 9-4　RNAの変性と電気泳動 233 9-5　RNAの染色とメンブレンへのトランスファー 236 9-6　ハイブリダイゼーション 238 9-7　洗浄とオートラジオグラフィー 240§10.Helper活性の測定 〈田合ひろみ　村口　篤〉242 10-1　ELISAによるIgの測定 242 10-2　T，B細胞の分離 245 10-3　helper T細胞活性の定量 245§11.Killer細胞活性の測定法 〈高木秀二〉250 A.cytotoxicity test 250 B.NK活性 254 C.ADCC 257 D.CTL活性 257 E.LAK活性 259§12.in vitro特異抗体産生の測定法 262 A.上清中の抗体測定 〈四宮範明〉262 B.特異抗体産生細胞数の測定 〈野間　剛〉268§13.IL-2反応性の測定 〈野間　剛〉277 A.PHA刺激によるリンパ球のIL-2反応性 278 B.自己nonT細胞刺激によるT細胞のIL-2反応性 279 C.特異抗原刺激によるIL-2反応性の誘導 281 D.特異抗原刺激によるIL-2レセプター発現の測定 284 E.特異抗原刺激リンパ球のIL-2吸収能の測定 284 F.その他のIL-2反応性 285§14.遊離レセプター測定法 288 14-1　可溶性IL-2レセプター測定法 〈坂田研明　高月　清〉288 14-2　可溶性IL-6Rの測定法 〈藤咲　淳　大杉義征　福井博泰　保川　清　岸本忠三〉296 A.sIL-6Rの測定法 296 B.全身性エリテマトーデス(SLE)患者髄液中のsIL-6Rの測定 299 14-3　可溶性FcεRII(CD23) 〈末村正樹〉302§15.細胞回転分析 〈高瀬浩造〉307 A.細胞回転分析の意義と目的 307 B.実際の方法 308 C.他のマーカーとの組み合わせ 310 D.問題点 311 E.実際の分析結果 311§16.TcR，Ig遺伝子再編成の検出法 〈柘植郁哉　松岡　宏　鳥居新平〉312 A.抗原レセプター遺伝子の構成と再編成の解析法 312 B.サザン法 316 C.遺伝子クローニング 319 D.PCR法 321§17.リンパ球コロニー形成法 323 17-1　T細胞 〈北村　聖〉323 A.T細胞コロニー形成法概略 324 B.一段階法one step method 325 C.二段階法two step method 328 D.T細胞コロニー形成の問題点 329 17-2　B細胞コロニー法 〈熊谷俊一〉333 A.ヒトB細胞コロニー法 333 B.軟寒天を用いるB細胞コロニー形成法 335§18.遅延型皮膚アレルギー反応 〈北郷　修〉343 18-1　DNCB感作試験 343 18-2　KLH皮膚反応 348 18-3　PHA皮膚反応 350 18-4　ツベルクリン反応 351 18-5　SK-SD遅延型皮膚反応 354 18-6　カンシダ抗原による遅延型皮膚反応 355付1.単球の同定法，分離法，除去法 〈安保　徹〉360 1-1　単球の同定法 361 A.酵母貧食法による単球の同定 361 B.ペルオキシダーゼ染色法による単球の同定 362 C.非特異的エステラーゼ染色法による単球の同定 364 1-2　単球の分離法 366 A.血清前処理シャーレとキレート剤を用いる方法 366 1-3　単球の除去法 368 A.ナイロンウールカラム法による単球の除去 368 B.silicaによる単球の機能的除去法 368付2.腫瘍免疫の証明法 〈佐藤昇志　菊地浩吉〉371 A.癌細胞自家移植 372 B.癌細胞と患者リンパ球による中和試験 373 C.癌細胞抗原による皮膚反応 374 D.癌組織におけるリンパ球反応 374 E.癌細胞-リンパ球混合培養 375 F.マクロファージ遊走阻止試験(MIT) 377 G.白血球遊走阻止試験 378 H.癌細胞障害試験 378付3.ヒトモノクローナル抗体作製へのEBウイルストランスフォームB細胞の利用 (水野文雄　大里外誉郎)381 A.EBVによるヒトモノクローナル抗体作製の概略 381 B.EBV感染によるヒトBリンパ芽球株(LCL)の樹立法 382 C.EBVトランスフォームリンパ球のクローニング 383 D.目的とする抗体産生クローンの選択効率を高める法 387 E.抗体スクリーニング 388 F.本法によるヒトモノクローナル抗体作製に適した抗原 388 G.本法によるヒノクローナル抗体の産生量 389付4.T細胞のクローニング 〈楠洋一郎　秋山實利〉392 4-1　クローニングの実際 392 4-2　応用 398付5.ヒトT-Tハイブリドーマの作り方 〈浅田　誠〉403 A.ヒトリンパ球の調製 404 B.細胞融合 404 C.ハイブリドーマ選択法 406 D.クローニング 412 E.ハイブリドーマの解析 412付6.リンパ球の凍結保存法 〈高木秀二〉414 II.マウスリンパ球機能の検索法§1.マウスリンパ球の秩「イ製法 419 1-1　リンパ球浮遊液の調製 〈藤原道夫〉419 A.脾臓，リンパ節，胸腺細胞浮遊液の調製 419 B.骨髄細胞浮遊液の調製 422 C.その他 423 1-2　死細胞の除去法 〈藤原道夫〉426 A.Sephadex G-10 カラム法 426 B.比重遠心法 427 C.その他 428 1-3　その他の臓器中のリンパ球の分離法 429 A.肝 〈安保　徹〉 429 B.腸管 〈鈴木健司　大塚和朗〉435§2.リンパ球の抗原レセプターおよび膜抗原の同定法　フローサイトメトリーを中心として 442 2-1　T細胞抗原レセプター 〈松崎吾朗〉442 2-2　T細胞膜抗原 〈安保　徹〉449 2-3　免疫グロブリンレセプター 〈鍔田武志〉462 A.フローサイトメトリーによるB細胞Igレセプターの同定法 463 B.フローサイトメトリーによるプレB細胞Igレセプターの同定法 464 C.免疫沈降法によるIgレセプター同定法 464 2-4　B細胞膜抗原 〈水口純一郎〉467§3.組織中のリンパ球の同定法 〈倉島知恵理　池田　通　廣川勝〉470 A.免疫組織学的検出法 470 B.in situハイブリダイゼーション法 476§4.リンパ球の単離法 482 4-1　フローサイトメトリー 〈松田浩則　八木田秀雄〉482 4-2　T細胞(サブセット)の単離 〈藤原道夫〉495 A.ナイロンウールカラム法 495 B.抗体と補体とによる処理 497 4-3　B細胞の単離 〈水口純一郎〉499 A.Panning法 499 B.補体依存性細胞溶解 500 C.ハプテン特異的Bリンパ球の単離法 501付1.単球・マクロファージ・樹状細胞の単離法と除去法 〈稲葉カヨ〉504 1-1　マクロファージの単離法 505 A.腹腔マクロファージ 505 B.脾臓マクロファージの単離 508 C.肺胞マクロファージの単離 510 1-2　樹状細胞の単離胞 511 A.脾樹状細胞の単離 512 B.LANGERHANS細胞の単離 515 1-3　マクロファージ，樹状細胞の除去法 518 A.カラムによる除去法 518 B.付着性細胞の除去 519 C.炭化鉄粉(カーボニルアイアン)を用いた貧食細胞の除去 520付2.抗原提示機能の測定法 〈矢野明彦〉522§5.リンパ球のin vitro培養とクローニング 532 5-1　in vitroの培養法 〈稲葉カヨ〉532 A.in vitro培養条件設定のための諸注意 532 B.培養の実施 534 5-2　T細胞クローンの樹立法 538 A.T細胞ハイブリドーマ 〈成内秀雄〉538 B.IL-2を用いる方法 〈高島　洋　木本雅夫〉544 5-3　胸腺の器官培養法 〈鈴木　元〉550 A.概要 550 B.胸腺摘出法 550  C.器官培養法 551 D.細胞移入実験 552  E.胸腺内T細胞分化の修飾 553 5-4　血液幹細胞の培養法 〈松崎有未　中西啓光〉555 5-5　B細胞の培養法 〈西川里美　西川伸一〉561 A.ストローマ細胞株PA6とST2 561 B.プレB細胞のストローマ細胞上での培養 561 C.ストローマ細胞依存性B細胞株の樹立とクローニング 563 D.PA6ストローマ細胞株とIL-7を用いたB細胞分化の解析法 565 5-6　リンパ球の凍結保存と回復法 〈高島　洋　木本雅夫〉5705-付　B細胞ハイブリドーマによるモノクローナル抗体の作製法 〈成内秀雄〉574§6.抗体産生細胞(PFC)の検出法 〈藤原道夫〉577 6-1　標的赤血球の調製法 577 A.蛋白質抗原のcoupling　CrCl3を用いる方法 577 B.ハプテンのcoupling 579 C.protein A-SRBCの調製 580 6-2　CUNNINGHAMの方法 582 6-3　ELISAによる抗体活性の測定 588§7.細胞障害性Tリンパ球の測定法 〈永井由美子　上出利光〉593 7-1　誘導法 593 A.in vitro誘導法(MLR) 593 B.in vivo誘導法(in vivo priming) 594 7-2　活性測定法 595 A.中和試験(Winn's test) 596 B.顕微鏡法 597 C.標識法 598 D.パーフォリンの検出法 600 E.セリンエステラーゼ活性測定法 6017-付　NK細胞の測定法 605 A.分離法 605 B.誘導法 605 C.活性測定法 606§8.サイトカインの誘導とアッセイ法およびサイトカインレセプターの検出法 608 8-1　IL-1 〈笠原　忠〉608 A.IL-1の産生誘導とアッセイ法 608 B.IL-1レセプター(IL-1R)の検出法 610 8-2　マウスIL-2 〈田中稔之〉616 A.IL-2産生能 616 B.IL-2活性の測定 617 C.サイトカインレセプターの検出法 617 8-3　IL-3 〈東條有伸〉624 A.IL-3の産生誘導 624 B.IL-3の測定 625 C.IL-3レセプターの検出法 627 8-4　IL-4 〈野間隆文〉629 A.IL-4の調製法とその活性測定法 629 B.IL-4レセプターの検出法 633 8-5　IL-5 〈菊池雄士　高津聖志〉638 A.IL-5の産生誘導法 638 B.IL-5の測定法 640 C.IL-5の受容体の検索法 642 8-6　IL-6 〈楢崎雅司〉646 A.フローサイトメトリーによるIL-6R，gp130の検出 647 B.免疫沈降によるIL-6R，gp130の検出 647 8-7　IL-8 〈原田明久　松島網治〉650 A.IL-8産生細胞と刺激誘導物質 650 B.IL-8の測定法 651 C.IL-8レセプターの検出法 657 8-8　インターフェロン(IFN) 〈今西二郎〉660 A.インターフェロン-αおよびβの産生法 660 B.インターフェロン-γの産生法 660 C.インターフェロン測定法 661 D.インターフェロンレセプターの検出法 663 8-9　Tumor necrosis factor(TNF) 〈川島貴雅　荒井澄夫〉665 A.TNFの誘導 665 B.TNF活性の測定 667 C.ELISA法 669 D.レセプターの検出法 670 8-10　マクロファージ活性化因子(MAF) 〈高須賀直美　赤川清子〉672 8-11　TGF-βの測定法とTGF-βレセプターの検出法 〈野間隆文〉678 A.サンドイッチELISA法によるTGF-βの定量 678 B.TGF-βレセプターの検出法 684§9.細胞接着分子の検出法 〈反町典子　飛田良美　宮坂昌之〉688§10.リンパ球機能検索のための発生工学的手法 695 10-1　トランスジェニックマウスの作製法 〈宮崎純一〉695 A.トランスジェニックマウスのその利用 695 B.トランスジェニックマウスと作製法 695 C.導入する遺伝子の効率良い発現を得るための工夫とDNAの調製法 697 D.トランスジェニックマウスの免疫研究への応用例 700 10-2　gene targeting 〈久野淳子　野田哲生〉703 A.ジーンターゲティングによる変異マウスの作製 703 B.ターゲティングベクターの作製 704 C.組み換えベクターのES細胞への導入 709 D.相同遺伝子組み換え体の同定 711 E.変異ES細胞からの変異マウスの作製 713 10-3　受精卵の凍結と回復法 〈豊田　裕〉715§11.リンパ球機能検索のための分子遺伝学的方法 723 11-1　T細胞レセプター遺伝子の分離と同定法 〈吉開泰信〉723 A.ゲノムDNA上T細胞レセプター遺伝子の分析 723 B.再構成T細胞レセプター遺伝子の解析 730 11-2　抗体遺伝子のrearrangement(再構成)の検査法 〈森　啓子　渡辺　武〉737§12.リンパ球のシグナル伝達の解析法 747 12-1　T細胞におけるシグナル伝達系の解析 〈斉藤　隆　石田康生〉747 A.チロシンリン酸化反応の解析 749 B.抗原刺激に伴うイノシトール代謝の測定法 754 C.活性化に伴う，細胞内Ca2＋濃度変化の測定法 757 12-2　B細胞について 〈野村　純　阪口薫雄〉765 A.B細胞の分化，発達 765 B.細胞の分化，増殖誘導のメカニズム 766 C.B系細胞の分離，培養 768検索法一覧 777000

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